معلومة

لماذا يعتبر PEG مهمًا لتحويل الخميرة بكفاءة؟

لماذا يعتبر PEG مهمًا لتحويل الخميرة بكفاءة؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تتمثل إحدى طرق إجراء تحويل الخميرة في استخدام أسيتات الليثيوم ، وحمض نووي ناقل أحادي الجديلة ، و PEG (1). كنت أتساءل لماذا يعتبر البولي إيثيلين جلايكول مهمًا للتحول الفعال. كيف تؤثر على امتصاص الحمض النووي الغريب؟ أظهر Yamakawa et al (2) أن PEG ضروري لاستعادة الخلايا ولكن لم أتمكن من الوصول إلى تلك الورقة لقراءة المزيد عنها.

1. R Daniel Gietz & Robert H Schiest (2007). تحويل الخميرة عالي الكفاءة باستخدام طريقة LiAc / SS DNA / PEG

2. Yamakawa، M.، Hishinuma، F. and Gunge، N. (1985). تحول الخلايا السليمة من Saccharomyces cerevisiae بواسطة البولي إيثيلين جلايكول. الزراعية. بيول. تشيم. 43 ، 869-871.


http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/26634.html

لقد وجدت هذا الرابط - يقول "لا نعرف حقًا". تقول إن PEG يربط الحمض النووي ، أفترض حماية الغشاء من شحنته السالبة والسماح بحدوث الاستبطان.

أعتقد أن الطبيعة البرمائية لـ PEG ، كونها كارهة جزئيًا للماء ، تساعد أيضًا على تليين الغشاء. ومن المثير للاهتمام ، إذا قمت بزيادة تركيز PEG إلى ما هو أبعد من الحدود ، فإنه يقلل من كفاءة الإجراء.


أفترض أن لها وظيفة مماثلة في المخازن المؤقتة للربط. يبدو أنه هناك يأخذ نسبة كبيرة من الحجم وبالتالي يزيد من فرصة التفاعل بين أجزاء الحمض النووي.

في المخزن المؤقت للتحول ، يجب أن يزيد من فرصة دخول الحمض النووي إلى الخلية. لسوء الحظ ، كان المرجع الوحيد الذي وجدته لهذا في Bitesizebio: http://bitesizebio.com/20/5-dna-ligation-tips/


استخدام الحمض النووي للحيوانات المنوية للسلمون في تحويل الخميرة؟ - (يونيو / 26/2006)

سأقوم بتحويل ناقل إلى pichia pasoris ، لكن البروتوكول ينص على أنه يجب استخدام الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون ، حتى الآن أعرف فقط أنه يُستخدم كعامل مانع ، ولكن هل يُستخدم أيضًا كعامل مانع في حالة التحول؟ أي شخص يعرف ما هذا؟ وكيف يعمل ؟؟

يتم استخدام ssDNA لخصائص الناقل أيضًا عند تعجيل مزيج الربط الخاص بك.

سأقوم بتحويل ناقل إلى pichia pasoris ، لكن البروتوكول ينص على أنه يجب استخدام الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون ، حتى الآن أعرف فقط أنه يُستخدم كعامل مانع ، ولكن هل يُستخدم أيضًا كعامل مانع في حالة التحول؟ أي شخص يعرف ما هذا؟ وكيف يعمل ؟؟

لقد وجدت مجلة ن مراجعة حول استخدام المخزن المؤقت للحامل DNA (الحمض النووي للحيوانات المنوية) في تحويل الخميرة. من المراجع ، استنتجت أن وظيفة الحمض النووي للحيوانات المنوية في تحول الخميرة هي تقليل ارتباط الغشاء بالبلازميد. كما نعلم ، تختلف خلية الخميرة مع خلية البكتيريا. في الخميرة ، يمكن لغشاءها أن يربط البلازميد ، لذلك إذا أدخلنا البلازميد إلى الخميرة دون إضافة الحمض النووي الناقل ، لذلك فقدنا بلازميدنا بكميات كبيرة.

كاتب المراجعة هو جيتز .. ن مجلة هينين.

لم أتمكن من العثور على مجلة gietz :-(

إذا كنت تريد المراجع يمكنك الاتصال بي على [email protected]

أهلا،
يمكنك قراءة هذه المقالات. سوف يساعدونك في أغراض استخدام جميع المكونات الكيميائية والبيولوجية.
أجرينا تحويل الخميرة من أجل إخراج الجين ، وقمنا بتطبيق البروتوكولات في هذه المقالات. لذا ، فهو يعمل.

1-) تحويل الخميرة عالي الكفاءة باستخدام طريقة LiAc / SS DNA / PEG


لماذا نحتاج إلى خلايا الخميرة المختصة؟

تتضمن الإعدادات المذكورة أعلاه إدخال الحمض النووي الغريب في الخميرة في مرحلة ما أثناء العملية التجريبية. يتم تحقيق إدخال شظايا الجينات (ssDNA الخطي أو البلازميدات) عن طريق تحويل خلايا الخميرة إما من خلال الطرق الكيميائية (على سبيل المثال ، أسيتات الليثيوم والبولي إيثيلين جلايكول (PEG)) أو من خلال التثقيب الكهربائي.

الأهم من ذلك ، يتطلب تحويل الخميرة الفعال البدء بخلايا خميرة عالية الجودة. تشير الكفاءة إلى قدرة الخلايا على تناول المواد الجينية خارج الخلية (على سبيل المثال ، DNA البلازميد). ستخبرك هذه المقالة بالضبط بكيفية تحقيق ذلك ، ونأمل أن تضعك جيدًا في طريقك نحو نجاح تحويل الخميرة!


تحول الخميرة

واحدة من أهم تقنيات البيولوجيا الجزيئية الحديثة هي القدرة على إدخال جين معين في الكائن الحي والحصول على تلك المعلومات الجينية التي يعبر عنها الكائن الحي. هذه العملية ، ودعا التحول الجيني، لعب دورًا حاسمًا في تاريخ البيولوجيا الجزيئية واكتشاف أن الحمض النووي هو المادة الجينية. أظهر أربعة علماء ، جريفيث في عشرينيات القرن الماضي وأفيري ومكارتي وماكلويد في الأربعينيات من القرن الماضي ، أن "التحول" الواضح لنوع بكتيري إلى آخر يتطلب الحمض النووي وليس جزيءًا بيولوجيًا آخر.

اليوم ، لا يقتصر التحول على البكتيريا ، وفي الواقع ، يتم استخدامه بشكل روتيني من قبل علماء الأحياء الجزيئية لمعالجة ودراسة سلوك الجينات. تستخدم هذه التجربة خميرة الخبازين (خميرة الخميرة). كنظام نموذجي ، تتمتع الخميرة بميزة على البكتيريا ، لكونها كائن حقيقي النواة له تنظيم خلوي مثل النباتات والحيوانات ، بما في ذلك البشر. يتضمن تحويل الخميرة عدة خطوات. بعد الانتهاء من هذه الخطوات ، ستعبر الخميرة عن الخصائص الجديدة أو النمط الظاهري من الحمض النووي المضاف.

تجربة: تستخدم هذه التجربة سلالة خميرة معيبة في جين تخليق الأدينين ، ADE1. يؤدي الخلل الأيضي في الطفرات إلى احتياجها للأدينين للنمو وتراكم صبغة حمراء تؤدي إلى ظهور المستعمرات باللون الوردي أو الأحمر. عندما تكون هذه ade1 يتم تحويل الخميرة الطافرة مع الطبيعي ADE1 الجين ، يكتسبون القدرة على النمو في حالة عدم وجود الأدينين وتشكيل مستعمرات ذات لون كريمي طبيعي.

جزيئات الحمض النووي المستخدمة في نظام التحويل هذا هي البلازميدات ، وقطع صغيرة دائرية من الحمض النووي. تتصرف بعدة طرق مثل الكروموسومات الحقيقية التي تحمل الجينات في الخلايا ولكن البلازميدات أكثر ملاءمة. هناك نوعان من البلازميدات التي تحمل الخميرة ADE1* الجين متاح للاستخدام في هذه التجربة. يوجد بلازميد YEpADE1 في نسخ متعددة في كل خلية خميرة محولة ومع ذلك ، فهو غير مستقر ويمكن فقده من الخميرة المحولة بتردد عالٍ نسبيًا. يوجد بلازميد YCpADE1 في نسخة واحدة في خلية خميرة أحادية الصيغة الصبغية ، تمامًا مثل الكروموسومات الطبيعية ، وبما أنه يحمل مركزًا للخميرة ، فسيتم فرزها بثبات في الخلايا الوليدة في كل مرة تنقسم فيها الخميرة. يمكن استخدام أي من البلازميد بشكل فعال لإثبات ظاهرة التحول.

* المستنسخة ADE1 تم توفير الجين المستخدم في هذه البلازميدات من قبل الدكتور ديفيد كاباك من كلية الطب وطب الأسنان بجامعة نيو جيرسي.

الجدول الزمني:

إذا حضنت ثقافتك عند 30 درجة مئوية ، فستتمكن من اتباع هذا الجدول في درجة حرارة الغرفة ، وقد تضطر إلى مضاعفة الوقت بين الخطوات.

اليوم السابق: 15 دقيقة للاستعداد
اليوم الأول: 50 دقيقة حول الخلايا
اليوم الخامس: 20 دقيقة راقب وحلل النتائج

المواد:

  • DNA / خليط ناقل البلازميد ، 1 ميكروغرام (ميكروغرام) YEpADE1 أو YCpADE1 بالإضافة إلى 20 ميكروغرام DNA لحيوان منوي السلمون المحوَّل بالحرارة
  • 1-3 لوحات MV
  • 3-4 أنابيب معقمة 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
  • الماصات المعقمة أو الماصات الدقيقة أو الأنابيب ذات الشعيرات الدقيقة
  • المسواك المعقمة
  • نثرات مشبك الورق المعقمة أو موزعات الزجاج والكحول واللهب
  • سلالة HA1L أو HA1 (ade1)
  • لوحات YED (1 لكل 4-5 فرق)
  • أجهزة الطرد المركزي الدقيقة أو أجهزة الطرد المركزي السريرية
  • حمام مائي (42 درجة مئوية) وطوافة من الستايروفوم
  • ماء معقم (مقطر)
  • حلول معقمة:
    1. محلول LiAc / TE (1x)
    2. محلول TE (1x)
    3. 40٪ حل PLT

يستعد:

نصائح للمعلمين
نصيحة فنية: يجب أن يكون التعليق عكرًا تمامًا. يساعد حل LiAc / TE في جعل خلايا الخميرة كفؤة (جاهزة للتحول).
نصيحة فنية: يتم خلط الحمض النووي YEpADE1 أو YCpADE1 البلازميد بحمض نووي غير محدد أو صوتي أو مجزأ يعمل كحامل. هذا الحمض النووي الناقل يجعل التحول أكثر كفاءة وربما يساعد على حماية DNA البلازميد من النيوكليزات الخلوية التي من شأنها أن تدمر البلازميد.
نصيحة فنية: تأكد من تعليق الخميرة جيدًا قبل النقل.
نصيحة فنية: يساعد محلول PLT بنسبة 40٪ على إجبار DNA البلازميد على خلايا الخميرة المختصة.

تحويل الخلايا:

2. تحضير DNA / أنابيب DNA الناقل. إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم جديد ، أضف 21 ماي من مزيج DNA / DNA البلازميد. قد ترغب في عمل بعض أنابيب التحكم. بعض الأمثلة على أنابيب التحكم المحتملة هي
1) الحمض النووي الناقل فقط
2) DNA البلازميد فقط
3) لا DNA

3. أضف الخميرة إلى أنابيب الحمض النووي. إلى أنبوب (أنابيب) الحمض النووي الذي أعددته ، أضف 0.2 مل لكل أنبوب من الخميرة / LiAc / TE من الخطوة 1. تجاهل باقي الخميرة / LiAc / TE المعلق.

4. إلى تعليق (معلقات) الحمض النووي / الخميرة ، أضف 1.2 مل من محلول PLT 40٪ لكل أنبوب.

5. أغلق الأنبوب بإحكام واخلطه جيدًا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

6. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تقريبا.

7. صدمة الحرارة لمعلق (معلق) DNA / الخميرة / PLT لمدة لا تقل عن 5 دقائق (بحد أقصى 15 دقيقة) في حمام مائي 42 درجة مئوية.

8. الطرد المركزي المعلق لتكوير خلايا الخميرة. (نصائح المعلم)
نصيحة فنية: يتم استخدام محلول TE لاستبدال حلول LiAc و PLT للطلاء.
نصيحة فنية: يوفر وسيط MV الحد الأدنى من العناصر الغذائية ومصدر للطاقة والفيتامينات. MV لا يزود الأدينين.

تصفيح الخلايا:
9. تخلص من المادة الطافية (محلول سائل) من أنبوب (أنابيب) الميكروفوج.

10. إعادة تعليق خلايا الخميرة الحبيبية عن طريق إضافة 1 مل من محلول TE. اضغط بلطف ، استخدم عود أسنان أو دوامة معقمة لتعليق الخلايا في محلول TE.

11. تعليق لوحة على MV أجار. من كل أنبوب تعليق خميرة ، استخدم ماصة معقمة جديدة لنقل 0.2 مل من تعليق الخميرة إلى كل لوحة أو لوحتين MV (وسط انتقائي). استخدم رشاشًا جديدًا معقمًا لنشر الخلايا من كل أنبوب بالتساوي على سطح الأجار. نصائح للمعلمين
12. احتضان الأطباق لمدة 3-5 أيام في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة 30 درجة مئوية.

مراقبة وتحليل النتائج:

1. ما هي الخلايا التي يمكن أن تنمو على MV (تلك التي تحتوي على بلازميد ADE1 أو بدونه)؟ اشرح نتائجك من حيث وجود أو عدم وجود البلازميد.

2. قارن لوحة DNA البلازميد الخاصة بك مع الآخرين في الفصل. هل كل اللوحات لها نفس العدد من المستعمرات؟ هل كانت المستعمرات كلها بنفس اللون؟ هل كانت لوحات YCpADE1 ولوحات YEpADE1 متماثلة؟ اكتب تفسيرًا لأي اختلافات لوحظت في صفك.

3. هل تحتوي أي من لوحات التحكم على مستعمرات؟ إذا قدموا تفسيرا محتملا.


تحول الخميرة

يعتمد هذا البروتوكول على Gietz و R.D. و R.A. الغابة. (2002) تحويل الخميرة بواسطة Liac / SS CARRIER DNA / طريقة الربط. طرق في علم الإنزيمات 350: 87-96. تستند بعض خطوات هذا البروتوكول إلى المعلومات التي تم الحصول عليها من:

هذا البروتوكول معمم ولا يعتبر الأمثل لجميع السلالات والظروف والتطبيقات. قد يتعين تعديل بعض جوانب هذا البروتوكول بشكل كبير لتلائم احتياجاتك الخاصة. إنه يعمل من أجل التحول البسيط ، والاستهداف في الخميرة ، وإصلاح GAP ، والتحولات متعددة البلازميد لاثنين من الهجين.

1) خط الخميرة أو التصحيح على YAPD لمدة 24-48 ساعة. يمكن أيضًا استخدام الخميرة من الأطباق القديمة (3 أشهر؟ عند 4 درجات) إذا لم تكن الكفاءة مشكلة وتعاونت السلالة.

2) تلقيح ثقافات 2 × 3-5 مل في وسائط 2xYAPD أو SC (أنابيب الغطاء المفاجئ 15 مل) من الخط الجديد واحتضان O / N 30 درجة ، 200 دورة في الدقيقة. قد تحتاج وسائط SC إلى البذر بشكل أكبر (أو قد يلزم المزيد من الأنابيب).

يمكن استبدال YAPD بـ 2xYAPD ولكن الكفاءة ستنخفض بعضًا وستستغرق الخميرة وقتًا أطول لتنمو.

1) ما قبل التسخين 50 مل 2 × YAPD إلى 30 درجة في دورق سعة 500 مل (10 دقائق على الأقل). قم بتشغيل حمام مائي 42 درجة (يستغرق 30 دقيقة أو أكثر).

2) تمييع ثقافة O / N 1:10 في الماء وخذ OD عند 600 نانومتر. استخدم 2xYAPD (أو YAPD أو SC عند الاقتضاء) مخفف 1:10 في الماء كفراغ. عادة ما يكون للثقافة المخففة OD يتراوح بين 0.1 و 1.0.

3) تمييع الثقافة إلى ما يقرب من 0.1 OD في 50 مل 2xYAPD قبل التسخين واحتضان 3-6 ساعات حتى يصل OD إلى 1.0 (أو قريب). تختلف معدلات نمو الخميرة ، لذا كن مستعدًا للانتظار. عادة ما يستغرق الأمر من 5 إلى 6 ساعات ولكن قد يستغرق وقتًا أطول قليلاً.

مثال: الثقافة المخففة في الخطوة 2 لها OD أو 0.2 لذا فإن الثقافة OD هي 2.0. للحصول على OD يبلغ 0.1 تقريبًا للخطوة 3 ، يمكنك إضافة 2.5 مل من الثقافة إلى 50 مل 2 × YAPD المُسخَّن مسبقًا (تخفيف 20 مرة). من الواضح أن الأمر ليس دقيقًا لأنه سيكون لديك الآن 52.5 مل بدلاً من 50 مل ولكنه قريب بما يكفي. إذا كنت تريد ذلك بالضبط ، يمكنك ببساطة إزالة 2.5 مل 2 × YAPD من القارورة قبل إضافة ثقافتك 2.5 مل ولكن هذا ليس ضروريًا.

4) بيليه 3000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة عند RT في RT6000 أو أجهزة طرد مركزي مماثلة.

5) أثناء غزل الخميرة ، اغلي سمك السلمون المنوي DNA لمدة 5 دقائق مع غطاء الغليان وقم بتبريده على الثلج. استخدم 3-4 مرات (التخزين عند -20) واحصل على أنبوب جديد. لا تغلي مرة بعد مرة.

6) إعادة التعليق في 1 مل ddH2O ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.

7) دوامة 1 دقيقة أو حتى الخميرة في حالة تعليق (بدون كتل).

8) بيليه بأقصى سرعة ، 30 ثانية ، RT وإعادة التعليق في 1 مل ddH2O عن طريق دوامة كما كان من قبل. سيتم استخدام 100ul لكل عملية تحويل بحيث يكون هناك ما يكفي من الخميرة لإجراء 10 تحويلات.

9) انقل 100 مايكرولتر من الخميرة إلى أنبوب منفصل سعة 1.5 مل لكل عملية تحويل وكرية بأقصى سرعة ، 30 ثانية ، RT وإزالة المادة الطافية.

10) لكل تحويل يشكل ما يلي (مزيج رئيسي أو منفصل):

50ul من 2mg / ml السلمون الحيوانات المنوية DNA

34ul أو البلازميد الخاص بك + الماء (1ul من DNA miniprep البكتيري كثير)

11) أضف مزيج (خلطات) التحويل إلى كريات الخميرة من الخطوة رقم 9 ودوامة دقيقة واحدة أو حتى تكون الخميرة في حالة تعليق (بدون تكتلات).

12) ضع الخميرة عند 42 درجة لمدة 40 دقيقة. للحصول على أفضل كفاءة ، يجب تحديد وقت الصدمة الأمثل تجريبياً ويمكن أن يتراوح من 10 دقائق إلى 60 دقيقة. من أجل اختيار واحد بسيط ، عادةً ما يعمل تحويل البلازميد 20-30 دقيقة بشكل جيد.

13) بيليه بسرعة قصوى ، 30 ثانية ، RT وإزالة مزيج التحويل.

14) أضف 1 مل ddH2O واستخدم طرف ماصة 1 مل لتحريك الخلايا في المحلول. إذا لزم الأمر ، قم بتقطيع الخميرة لأعلى ولأسفل برفق شديد.

15) لوحة 200ul على ألواح انتقائية مناسبة مقاس 100 مم أو 150 مم وتنمو 3-4 أيام عند 30 درجة. * بدلاً من 1 مل في الخطوة 14 ، يمكنك أيضًا إعادة تعليق الخميرة في 400ul ووضع الكمية بأكملها على لوحة واحدة بحجم 150 مم إذا كنت ترغب في ذلك.

تختلف الكفاءة اعتمادًا كبيرًا على الإجهاد وتحويل الحمض النووي. يمكن أن تختلف من 1 & # 21510 ^ 3 إلى 1 & # 21510 ^ 5 (أو نحو ذلك) مستعمرات لكل ميكروغرام من DNA المدخلات (لبلازميد DNA).

10 جرام من مستخلص خميرة BactoYeast

100mg هيميسولفات الأدينين

الأوتوكلاف 20 دقيقة في دورة السائل.

يختلف الوسيط الانتقائي بناءً على الإجهاد والتطبيق.

2 ملغ / مل في TE. سيجما D1626. اصنع 100 مل في دورق باستخدام محرض مغناطيسي. يستغرق 2-4 ساعات ليذوب. قسامة في أنابيب 1.5 مل (1 مل / أنبوب).

ضع 50 جم من البولي إيثيلين جلايكول ، MW 3350 (Sigma) في دورق زجاجي سعة 150 مل وأضف 35 مل من ddH20. يقلب لمدة 1-2 ساعة بقضيب تحريك مغناطيسي حتى يذوب. ف. إلى 100 مل واستمر في التقليب لمدة 10 دقائق على الأقل للخلط. التصفية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر وقسامة في مخروطي 15 مل (10 مل لكل منهما) وتخزينها في RT.

1.0M خلات الليثيوم. لا حاجة لدرجة الحموضة.

تيم شيدل ، دكتوراه
قسم علم الوراثة
صندوق الحرم الجامعي # 8232
كلية الطب بجامعة واشنطن
4566 سكوت افي.
سانت لويس ، مو 63110


تحويل الخميرة عالي الكفاءة باستخدام طريقة LiAc / SS DNA / PEG

نحن هنا نصف نسخة عالية الكفاءة من أسيتات الليثيوم / طريقة DNA / PEG الحاملة أحادية الشريطة لتحويل خميرة الخميرة. تعطي هذه الطريقة حاليًا أعلى كفاءة وإنتاجية للمحولات ، على الرغم من توفر بروتوكول أسرع لعدد صغير من التحولات. يستغرق الإجراء ما يصل إلى 1.5 ساعة ، اعتمادًا على طول الصدمة الحرارية ، بمجرد زراعة الخميرة. هذه الطريقة مفيدة لمعظم متطلبات التحويل.


استنساخ الحمض النووي المتكرر

سوزان جيه كارشر ، في البيولوجيا الجزيئية ، 1995

إجراءات التحول

الباحثون الذين يحققون في كفاءات التحول في بكتريا قولونية لاحظت تباينًا في قدرة التحويل لمستحضرات مختلفة من نفس البلازميد بالإضافة إلى التباين في دفعات مختلفة من بكتريا قولونية الخلايا (كونلي وسوندرز ، 1984). أظهر كونلي وسوندرز (1984) أن البلازميد pBR322 الخطي يتحول بكتريا قولونية بتردد أقل من 10 2 إلى 10 3 من DNA البلازميد pBR322 المغلق تساهميًا. تم جعل البلازميد خطيًا عن طريق القطع باستخدام نوكلياز داخلي مقيد يقطع مرة واحدة في البلازميد. Dagert and Ehrilich (1979) ، باستخدام 0.1 م كاكل2 لجعل الكفاءة بكتريا قولونية الخلايا ، لوحظ أن كفاءة التحول زادت كلما تم تخزين الخلايا على الجليد ، على الرغم من انخفاض قابلية الخلية للحياة مع فترة التخزين على الجليد. في تجاربهم ، حددوا تردد تحويل 2 × 10 7 محولات / ميكروغرام من pBR322 باستخدام مختص حديثًا بكتريا قولونية الخلايا. كان تكرار تحويل الخلايا المخزنة على الجليد لمدة 24 ساعة أكبر بست مرات وكانت نسبة أعلى من الخلايا القابلة للحياة (20 ٪) مختصة. انخفضت صلاحية الخلية بشكل مطرد في جميع أنحاء التخزين على الجليد. وصلت قابلية الخلايا للتحول إلى الحد الأقصى عند 24 ساعة من التخزين على الجليد وانخفضت مع فترة حضانة أطول على الجليد.

إينو وآخرون. (1990) درس بعناية العوامل التي تؤثر على كفاءات التحول في بكتريا قولونية. وجدوا أن نمو بكتريا قولونية أدت الخلايا عند درجة حرارة منخفضة إلى كفاءة تحويل أعلى. حددوا درجة الحرارة المثلى لنمو الخلايا لتكون 18 درجة مئوية عندما نمت إلى درجة حرارة أ600 من 0.75. قد يكون الوقت اللازم للوصول إلى هذه الكثافة عند درجة حرارة منخفضة يومين. باستخدام الإجراء الخاص بهم لصنع خلايا مختصة ، يحصلون على ترددات تحويل من 1 - 3 × 10 9 محولات / ميكروغرام pBR322 DNA. هذه الترددات قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام electroporation. (يستخدم Electroporation نبضًا من الكهرباء لإنشاء مسام في غشاء الخلية. ويمكن للحمض النووي أن يدخل الخلية بهذه الطريقة.) هذه الكفاءات العالية مطلوبة لإنشاء مكتبة cDNA كاملة لجينوم معقد.

سعى هاناهان لفهم طبيعة عملية التحول في بكتريا قولونية بمزيد من التفصيل ولتحسين كفاءة التحول في بكتريا قولونية. ابتكر هاناهان إجراءات التحول التي ، بالنسبة لسلالات معينة من بكتريا قولونية، زاد من كفاءة التحويل 100- إلى 1000 مرة أكثر من الكفاءة مع CaCl القياسي2 علاج او معاملة. تضمنت إجراءات التحويل المعدلة Hanahan & # x27s نمو الخلايا في 10-20 مم Mg 2+ ، متبوعًا بدمج الحمض النووي والخلايا في وجود أحد هذه المكونات الإضافية: 45 مم مينيسوتا 2+ 10 مم كاليفورنيا 2+ ، 100 مم Rb 2+ ، أو K + 7٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، 75 مم ديثيوثريتول (DTT) ، أو 3 مم هكسامين كوبالت (III) كلوريد. يلاحظ هاناهان أن ظروف استزراع البكتيريا (النمو في دورق كبير ، مع نسبة سطح إلى حجم كبيرة ، وإثارة قوية بدون رغوة) كانت مهمة لتحقيق كفاءات تحويل عالية ، لكن هذه الإجراءات لم تعزز كفاءات التحول الكل بكتريا قولونية سلالات درس. كان قادرًا على الحصول على 5 × 10 8 محولات / ميكروغرام من البلازميد pBR322 أو خلية واحدة محولة لكل 400 جزيء بلازميد.

اقترحت دراسات Hanahan & # x27s ثلاثة أدوار يمكن أن تلعبها الكاتيونات ثنائية التكافؤ في مساعدة التحول: (1) تحمي الكاتيونات ثنائية التكافؤ الشحنات السالبة على الحمض النووي (من مجموعات الفوسفات] وعلى السطح الخارجي للخلية (من فسفوليبيدات سطح الخلية وعديدات السكاريد الدهنية) لذلك يمكن أن يرتبط الحمض النووي ارتباطًا وثيقًا بالخلية بسهولة أكبر. تساعد على إعادة تنظيم عديدات السكاريد الدهنية بعيدًا عن القنوات التي عادةً ما تحرسها.

استخدام هذه البروتوكولات للتحويل بكتريا قولونية كانت الخلايا أداة قيمة في جعل استنساخ الحمض النووي المؤتلف ممكنًا. تم تطوير طرق بديلة لإدخال الحمض النووي في الخلية البكتيرية وفي الخلايا حقيقية النواة. لمراجعة بعض هذه الأساليب انظر Karcher (1994).


هل سبق لك أن خبزت أو شاهدت أحدًا يخبز الخبز؟ إذا كان الأمر كذلك ، فأنت تعلم أن الخميرة عنصر مهم جدًا في الخبز ، لأنها تعمل كعامل تخمير وتتسبب في ارتفاع الخبز. قد تتفاجأ عندما تسمع أن الخميرة هي في الواقع كائن حي! وبشكل أكثر تحديدًا ، الخميرة هي خلية مفردة حقيقيات النوى الكائنات الحية الدقيقة وبالتالي تحتوي على هياكل خلوية داخلية معقدة مماثلة لتلك الموجودة في الحيوانات والنباتات. اسمها العلمي هو خميرة الخميرة (شكل 1). معظم حقيقيات النوى كائنات متعددة الخلايا. الخلايا البشرية ، على سبيل المثال ، هي خلايا حقيقية النواة. هذا هو السبب في أن الخميرة ليست مهمة فقط لخبز الخبز ، ولكنها تلعب أيضًا دورًا رئيسيًا في البحث البيولوجي. بسبب تشابهها مع الخلايا البشرية ، أصبحت الخميرة قوية كائن نموذجي للدراسات البيوكيميائية والوراثية. على سبيل المثال ، العديد من الجينات البشرية التي لها دور في المرض لها نظائر في الخميرة. يسمح هذا للعلماء باختبار عقاقير جديدة على خلايا الخميرة أو دراسة آثار طفرات جينية معينة. باعتبارها كائنًا وحيد الخلية ، تتمتع الخميرة بفائدة إضافية تتمثل في إمكانية زراعتها والتلاعب بها باستخدام التقنيات القياسية المطبقة على البكتيريا.


شكل 1. خميرة (خميرة الخميرة) الثقافة التي يتم عرضها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

من أجل دراسة العمليات البيوكيميائية في الداخل خميرة الخميرة، غالبًا ما يكون من الضروري تغيير مادته الجينية الأصلية ، مثل إدخال طفرة معينة في الجين. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام الهندسة الوراثية تقنيات مثل الاستنساخ الجزيئي أو تحرير الجينوم. تسمح هذه التقنيات للباحثين بالتخلص من جين معين أو حذفه لدراسة وظيفته المحددة ، أو لإضافة جينات جديدة إلى خلية لتغيير خصائصها أو لإنشاء مسارات أيضية جديدة. خلق شيء كائن معدل وراثيا (GMO) يتضمن تقنيات متعددة وعدة خطوات. التقنيات المطبقة على الخميرة تشبه إلى حد بعيد التقنيات المطبقة على خلايا البكتيريا. بناءً على هدفهم البحثي ، عادةً ما يحدد المهندسون الجينيون أو يختارون الجين الذي يريدون تعديله أو إدخاله أو حذفه. في الخطوة التالية ، يجب تجميع جميع أجزاء الحمض النووي اللازمة لتعديل خلية الخميرة ثم إدخالها في الخلية. تسمى جزيئات الحمض النووي التي يتم تشكيلها بالطرق المختبرية لإنشاء تسلسلات جديدة للحمض النووي الحمض النووي معاد التركيب.

تسمى تقنية تكوين جزيئات الحمض النووي المؤتلف وتجميعها الاستنساخ الجزيئي. يمكن تصنيع تسلسلات الحمض النووي الجديدة أو المعدلة أو إنشاؤها باستخدام إحدى طرق الاستنساخ العديدة. تتضمن إحدى هذه الطرق قطع ولصق قطع الحمض النووي الموجودة معًا. لقطع شظايا الحمض النووي الموجودة ، أنزيمات التقييد غالبًا ما تكون قادرة على تفكيك الحمض النووي في موقع معين. بمجرد تفككها ، يمكن إدخال أجزاء جديدة أو معدلة من الحمض النووي ، أو جينات معينة ذات أهمية. الانزيم ligase DNA ثم يتم استخدامه لدمج أجزاء الحمض النووي الفردية للحمض النووي المؤتلف معًا. تتمثل الخطوة التالية في إدخال الحمض النووي المؤتلف حديثًا في خلية الخميرة. في الاستنساخ الجزيئي ، يتم ذلك عادةً باستخدام a المتجه. النواقل هي جزيئات الحمض النووي التي تحمل الحمض النووي المؤتلف إلى الخلية المضيفة. بمجرد دخول الخلية المضيفة ، يمكن بعد ذلك تكرار و / أو التعبير عن الحمض النووي الذي تم إدخاله. النواقل الأكثر استخدامًا هي البلازميدات (الشكل 2). البلازميدات عبارة عن جزيئات DNA دائرية تحدث بشكل طبيعي في الخميرة والبكتيريا. عادة ما تكون صغيرة ، منفصلة عن الحمض النووي للخلية ، وغالبًا ما تحمل الجينات التي توفر فائدة للخلية ، مثل مقاومة المضادات الحيوية. بالنسبة للهندسة الوراثية ، يتم إنشاء البلازميدات الاصطناعية ، ويتم دمج الجين المستهدف أو تسلسل الحمض النووي في DNA البلازميد. بهذه الطريقة يتم إدخال البلازميد بأكمله ، بما في ذلك الحمض النووي المؤتلف ، في خلية الخميرة.

تُظهر الخطوة الأولى البلازميد المؤتلف ، الذي يحتوي على الجين المستهدف مدمجًا في هيكله الدائري. تُظهر الخطوة الثانية البلازميد مع سهم يشير إلى رسم تخطيطي لخلية الخميرة. تحتوي خلية الخميرة على البلازميد مع الجين المستهدف. تُظهر الخطوة الثالثة رسمًا تخطيطيًا للوحة أجار انتقائية. تظهر خليتان من الخميرة تحتويان على البلازميدات الجينية المستهدفة فوق صفيحة الآجار مع أسهم تشير إلى صفيحة أجار. تُظهر الخطوة الخامسة والأخيرة منظرًا علويًا لصفيحة أجار بها العديد من الدوائر التي تمثل خلايا الخميرة.


الشكل 2. رسم تخطيطي يوضح بعض الخطوات المتبعة في توليد الخميرة المعدلة وراثيا.

يحدث التعديل الفعلي للمادة الوراثية للخميرة عندما يتم دمج الحمض النووي المؤتلف في خلية الخميرة. يسمى امتصاص البلازميد في خلية الخميرة تحويل. في المختبر ، يمكن بدء التحول باستخدام طرق متعددة ، مثل المعالجة الكيميائية لخلايا الخميرة ، أو التثقيب الكهربائي. يستخدم Electroporation نبضات عالية الجهد لزيادة نفاذية أغشية الخلايا ، مما يسمح للحمض النووي الغريب بدخول الخلية. أثناء التحول ، لن تتناول كل خلية خميرة البلازميد ، ولهذا السبب يجب تمييز خلايا الخميرة المحولة بنجاح عن الخلايا غير الناجحة. لهذا الغرض ، عادةً ما تحتوي البلازميدات المستخدمة في الاستنساخ الجزيئي على علامة انتقائية إضافية إلى جانب الجين المستهدف أو تسلسل الحمض النووي المتغير. تسمح هذه العلامة ، التي غالبًا ما تكون جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية ، بالنمو الانتقائي للخميرة المعدلة وراثيًا على لوحات أجار التي تحتوي على مضادات حيوية معينة. في كثير من الحالات ، يتم ترتيب أجزاء من DNA البلازميد لمحول ناجح لتأكيد وجود تسلسل DNA الصحيح في هذا الاستنساخ المعين.

لا تقتصر الهندسة الوراثية على الخميرة أو البكتيريا. يمكن تغيير جينومات النباتات والحيوانات بطريقة مماثلة. تم بالفعل هندسة العديد من النباتات الزراعية مثل الذرة والكانولا وفول الصويا وراثيًا لتحسين أدائها. هناك تطبيق آخر للكائنات المعدلة وراثيًا في صناعة المستحضرات الصيدلانية. اليوم ، يتم إنتاج العديد من الأدوية ، مثل الأنسولين لمرضى السكر أو بعض الأجسام المضادة ، عن طريق البكتيريا أو النباتات المعدلة وراثيًا. يبحث العلماء أيضًا في إنتاج منتجات أخرى ذات قيمة تجارية ، مثل حرير العنكبوت أو الوقود الحيوي أو اللقاحات.

في هذا المشروع ، ستقوم بإنشاء الخميرة المعدلة وراثيًا الخاصة بك. على وجه التحديد ، سوف تفعل خميرة الخميرة يتوهج من خلال تقديم أ جين البروتين الفلوري الأخضر (gfp) في حمضه النووي. ينشأ GFP من قنديل البحر وغالبًا ما يستخدم في التكنولوجيا الحيوية لتمييز خلايا معينة أو كجينة مراسلة تشير إلى ما إذا كانت الخلية تعبر عن بروتين معين. في هذه التجربة ، ستقوم بتحويل خميرة بلازميد تحتوي على gfp الجين خميرة الخميرة. ستقوم بهذا التحول باستخدام سلالات مختلفة من الخميرة. هناك العديد من سلالات الخميرة المختلفة ، بما في ذلك خميرة الخباز أو خميرة البيرة (التي تستخدم في صنع النبيذ أو لتخمير البيرة). سوف تتحقق مما إذا كانت كل من السلالات المختلفة قادرة على تناول بلازميد GFP أثناء التحول. هل تعتقد أنه يمكنك جعل كل سلالات الخميرة تتألق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية؟


ما بعد التكامل الجينومي & # x2013 تعدد الإرسال لتحسين المسار

يعد إدخال الجينات غير المتجانسة في الكائن الحي المضيف أمرًا أساسيًا لبناء مسارات غير متجانسة وإنتاج المنتجات المستهدفة. ومع ذلك ، فإن تحسين المسارات المنشأة الناتجة وحتى المسارات الأصلية أمر بالغ الأهمية أيضًا لتطوير مصانع خلايا ميكروبية فعالة. وبالتالي ، فإن عمليات حذف الجينات ، واضطرابات الجينات والقمع أو الإفراط في التعبير عن التعبير الجيني هي تطبيقات مهمة في نطاق هندسة الجينوم (Ko et al. ، 2020). بالنسبة للتكامل الجيني ، فإن تعدد إرسال مثل هذه التطبيقات لديه أيضًا القدرة على تسريع عملية تطوير الإجهاد ، كما أن تقنيات CRISPR / Cas9 ستثبت أيضًا أدوات قيمة في هذا السياق.

اضطراب متعدد الجينات في وقت واحد في S. cerevisiae تم تحقيقه لأول مرة عبر Homology-Integrated CRISPR-Cas (HI-CRISPR) (Bao et al. ، 2015). لتعطيل الجينات المستهدفة ، تم استخدام DNA مانح متماثل 100 زوج قاعدي يحتوي على حذف ثمانية نقاط أساس وسلسلة عزر مجاور (PAM) ، كقطعة مطفرة ، والتي تم إدخالها بين تسلسلات crRNA في مجموعة crRNA. تم التعبير عن مجموعة crRNA ، التي تحتوي على متواليات متعددة من الرنا الريباسي والجهات المانحة للاضطراب ، و tracrRNA تحت سيطرة المروجين المختلفين في بلازميد واحد الكل في واحد كما هو موضح في الشكل 7 أ. بعد معالجة مجموعة crRNA بواسطة نوكليازات المضيف (غير معروف) و RNase III ، شكلت tracrRNAs و crRNAs معقدًا لتوجيه متغير Cas9 المحسن ، iCas9 ، الذي تم اكتشافه أثناء الدراسة. باستخدام نهج HI-CRISPR ، فإن التعطيل الثلاثي لـ يمكن 1, ADE2، و LYP1 تم تحقيق كفاءة الجينات بنسبة 83٪ بعد 4 أيام من الحضانة في وسط تسرب اصطناعي. بالإضافة إلى ذلك ، اضطراب متزامن من ATF2, GCY1، و YPR1 تم تحقيق الجينات بكفاءة 100٪ بعد 6 أيام من الحضانة.

الشكل 7. (أ) نظام HI-CRISPR ، الذي استخدم ناقلًا واحدًا متعدد الإمكانات للتعبير عن iCas9 ، ومجموعة crRNA ، و tracrRNA وجزء مانح مطفّر لتعطيل الجينات المتعددة. (ب) طريقة تحرير متعددة الجينات تتضمن التعبير عن أشرطة متعددة الجرنا من خلال بلازميد تم إنشاؤه بواسطة استنساخ USER. تم التعبير عن Cas9 من قبل المضيف.

تم أيضًا استخدام نهج HI-CRISPR لتعطيل أربعة جينات في سلالات الخميرة ثنائية الصبغية وثلاثية الصبغيات مما أدى إلى حذف ثمانية أليل واثني عشر أليلًا ، على التوالي (Lian et al. ، 2018). بدلاً من التعبير عن crRNAs كما هو الحال في تصميم HI-CRISPR ، تم التعبير عن gRNAs بأرقام نسخ مختلفة. باستخدام بلازميدات تعبير gRNA عالية النسخ (& # x223C80 نسخة / خلية) ، تم تحقيق كفاءة حذف الجينات بنسبة 100 ٪ لأربعة جينات ، HIS3, TRP1, LEU2، و URA3 في كل من سلالة الخميرة ثنائية الصبغيات (الإيثانول الأحمر) وسلالة الخميرة ثلاثية الصبغيات (ATCC 4124).

على الرغم من تعطل أربعة جينات بكفاءة باستخدام نهج HI-CRISPR (Lian et al. ، 2018) ، انخفضت كفاءة تعطيل الجينات بشكل كبير عندما تم وضع تسلسل crRNA مستهدف في المركز الخامس في مجموعة crRNA (باو وآخرون ، 2015). في دراسة لاحقة ، ومع ذلك ، فإن Jako & # x010Dinas et al. (2015) تمكنوا من التغلب على هذا الاختناق عندما استهدفوا خمسة مواضع مختلفة في جينوم الخميرة للتحرير المتزامن لزيادة إنتاج الميفالونات. أربع جينات BTS1, YPL062W, YJL064W، و ROX1، عن طريق دمج كودون التوقف في تسلسل الجينات PAM. محفز الجين الخامس ، ERG9P، تم اقتطاعه أيضًا لتقليل تنظيم تعبيره. تم تجميع كاسيتات جرنا الفردية التي تحتوي على متواليات المروج والنهايات الخاصة بها باستخدام استنساخ المستخدم لبناء بلازميد تعبير جرنا متعدد. ثم تم التعبير عن Cas9 من بلازميد منفصل (الشكل 7 ب). أبلغ الباحثون عن كفاءة تحرير الجينوم بنسبة 100٪ باستخدام هذه الطريقة. تمت زيادة إنتاج الميفالونات إلى 10 & # x03 مليار متر مكعب في السلالة الناتجة المصممة على النحو الأمثل ، مما يمثل تحسنًا بمقدار 41 ضعفًا مقارنة بالسلالة البرية (Jako & # x010Dinas et al. ، 2015).

Csy4 هو نوكلياز داخلي الزائفة الزنجارية معبرًا عنه للتكوين الحيوي للكرنا (Haurwitz et al. ، 2012). على الرغم من أنه تم استخدامه لأول مرة لتحرير الجينوم المتعدد لخلايا الثدييات (Nissim et al. ، 2014) ، إلا أن Ferreira et al. (2018) أظهر قابليته للتطبيق على S. cerevisiae. تم استخدام Csy4 لزيادة كل من عمليات الحذف المتعددة والتنظيم المتعدد للجينات المستهدفة في S. cerevisiae. كان نوكلياز إندوريبون قادرًا على استهداف وقطع حلقة جذعية معينة تتكون من تسلسل نيوكليوتيد 28 نقطة أساس (Haurwitz et al. ، 2012). أعرب الباحثون بشكل عرضي عن أربعة جرنا ، مع المنطقة المستهدفة Csy4 المحصورة بينهما ، تحت سيطرة مروج واحد (مروج RNA Polymerase III ، SNR52) ، في سلالة خميرة تعبر عن Csy4 و Cas9 كما هو موضح في الشكل 8 أ. الحذف الرباعي لأربعة جينات ، FAA1, FAA4, TES1، و POX1، بكفاءة 96 ٪ باستخدام Csy4 ، مقارنة بكفاءة 50 ٪ فقط لحذف الجينات المزدوجة في غياب Csy4. A similar approach was also applied for the upregulation of three genome-integrated GFP genes under the control of three different promoters, HMG1, ACS1، و OLE1 (Ferreira et al., 2018). However, a dCas9-VPR activator was expressed by the gRNA expressing plasmid, whilst Csy4 was expressed by a second plasmid in the strain. Three different combinations of promoter targeting gRNAs were investigated leading to a two-fold increase in GFP expression compared to those strains not expressing Csy4.

الشكل 8. (أ) Csy4-based multi-gene editing method. gRNAs were expressed from a 2 μ plasmid while Cas9 and Csy4 were expressed by the host. Csy4 cleaved 28 bp stem-loop to release single gRNAs in the host. (ب) GTR-CRISPR method which benefits from tRNA sequences inserted between gRNAs. Up to eight genes could be edited using this method. All elements, multi-gRNAs and Cas9, were expressed by a single plasmid and endogenous RNase P and RNase Z were used to process tRNA containing transcripts to release gRNAs.

A maximum of eight efficient multi-gene disruptions was recently achieved using a gRNA-tRNA array for CRISPR-Cas9 (GTR-CRISPR) method. Eight genes (يمكن 1, ADE2, LYP1, TRP2, FAA1, FAA4, POX1, TES1) were simultaneously disrupted with 87% efficiency when optimal gRNA sequences were used (Zhang et al., 2019). In the GTR-CRISPR design, a tRNA جلاي sequence was inserted between each gRNA and two SNR52 promoters were used to each transcribe four of the eight gRNAs (Figure 8B). Endogenous tRNAs were processed by two enzymes RNase P and RNase Z, following transcription in a similar way to the Csy4-aided method. A single and complete plasmid including both the multiple gRNAs and Cas9 protein was constructed via Golden Gate assembly. To further streamline the method, an alternative approach, Lightning GTR-CRISPR, was also developed by the researchers. Without pre-assembly of the DNA fragments, the Golden Gate reaction mix was directly transformed into the yeast for في الجسم الحي الجمعية العامة. Through the expression of two gRNAs, under SNR52 promoters, 96% and 60% multiple disruption efficiencies were achieved for four (يمكن 1, ADE2, LYP1, TRP2) and six genes (يمكن 1, ADE2, LYP1, TRP2, FAA1, FAA4)، على التوالى. However, a dramatic decrease in efficiency was reported for the simultaneous disruption of eight genes.

The construction and simultaneous expression of multiple gRNAs are critical to multiplex genome engineering. Jakočinas et al. (2015) constructed a plasmid expressing five different gRNAs using USER cloning. However, as a USER cloning site was first integrated into a plasmid containing a single gRNA expression cassette, an additional step was required for the construction of a multiple gRNA expressing plasmid. This multi-gRNA expressing plasmid was co-transformed with donor DNAs into a Cas9-expressing yeast strain. For the HI-CRISPR method, on the other hand, Bao et al. (2015) made use of Golden Gate dependent assembly to construct an all-in-one HI-CRISPR system which expresses all of the required elements, donor DNA, crRNAs, tracrRNA and Cas9, in a single plasmid. This approach could therefore be applied in a yeast strain without the need for Cas9 expression. In an alternative method, Ferreira et al. (2018) expressed one more element, Csy4, to optimize multiple gRNAs expression and facilitate the expression of all gRNAs using a single promoter. Although the approach demonstrated good potential for the stable expression of multiple gRNAs, a maximum of four gRNAs were simultaneously integrated in the study. Further research is therefore needed to investigate its application for higher numbers of gRNA sequences. The GTR-CRISPR method appears to be the most efficient approach for the simultaneous disruption of large numbers of genes (Zhang et al., 2019). A modified version of this method was also utilized for the deletion of eight genes (four genes per round) in yeast lipid metabolism for increased free fatty acid production. As endogenous tRNA processing enzymes were used and Cas9 was expressed episomally, like HI-CRISPR, this method could theoretically be applied to any yeast strain without the need for genomic integrations. Nevertheless, all of the mentioned approaches present promising solutions for high-efficiency, simultaneous multiple gene disruptions or deletions.

Csy4-aided multiple up-regulation of triple targets was also shown in the aforementioned study (Ferreira et al., 2018). In addition to multiple gene deletions, multiple up-regulation or down-regulation of target genes can be very useful for the fine-tuning of metabolic pathways and production of target products. Lian et al. (2017) developed a tri-functional CRISPR system named CRISPR-AID to simultaneously up-regulate, down-regulate and delete three different target genes in the yeast genome. Researchers integrated homologous donor sequences into gRNA cassettes via the HI-CRISPR method and three CRISPR systems, one for activation, one for interference and one for deletion, were designed. The dCas9-VPR complex was used for up-regulation, dCas9-MXI1 complex for down-regulation and a catalytically active Cas9 was used for deletion. Firstly, the simultaneous five-fold activation of RFP, mCherry, five-fold interference of yellow fluorescent protein, mVenus and deletion of ADE2 gene with more than 95% efficiency was achieved using the CRISPR-AID method. Production of β-carotene was also increased 2.8-fold by simultaneously overexpressing a HMG1 gene, downregulating an ERG9 gene and deleting a ROX1 gene in a single CRISPR-AID genome engineering step.

Recently, seven genes in S. cerevisiae were simultaneously down-regulated (Ni et al., 2019), this is the greatest number of simultaneous down-regulation achieved in a single step in the species. To increase β-amyrin production, ADH1, ADH4, ADH5, ADH6, CIT2, MLS1، و ERG7 genes were down-regulated using a multi-gRNAs expression plasmid in a yeast strain expressing dCas9 (dead Cas9). A plasmid containing seven cassettes, each expressing one of the gRNAs along with its promoter and terminator, separated by random 20 bp sequences was constructed. Using this method alone, β-amyrin production was increased by 42% to 60 mg/L.

The methods discussed in this section highlight the applicability of multiple genome editing techniques for gene deletion, disruption, up-regulation or down-regulation. Such edits allow significant improvements in the productivity of metabolic pathways to be achieved without further gene integrations. Gene integrations increase both the metabolic burden on the host and the cost of the project. Minimizing the number of gene integrations, whenever possible, through the use of alternative approaches to metabolic pathway optimization is therefore an effective approach.


    Audergon PNCB, Catania S, Kagansky A, وآخرون.: Epigenetics. Restricted epigenetic inheritance of H3K9 methylation. Science. 2015 348(6230): 132–135. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Bähler J, Wu JQ, Longtine MS, وآخرون.: Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.Yeast. 1998 14(10): 943–951. PubMed Abstract | Publisher Full Text Ciccaglione KM: Adaptation of CRISPR/Cas9 to improve the experimental utility of the model system Schizosaccharomyces pombe. Master’s thesis Rutgers University. 2015. Publisher Full Text Cong L, Ran FA, Cox D, وآخرون.: Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 339(6121): 819–823. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Fantes PA, Hoffman CS: A Brief History of Schizosaccharomyces pombe Research: A Perspective Over the Past 70 Years. علم الوراثة. 2016 203(2): 621–629. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Fernandez R, Berro J: Use of a fluoride channel as a new selection marker for fission yeast plasmids and application to fast genome editing with CRISPR/Cas9. Yeast. 2016 33(10): 549–557. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hayashi A, Tanaka K: Short-Homology-Mediated CRISPR/Cas9-Based Method for Genome Editing in Fission Yeast. G3 (بيثيسدا). 2019 9(4): 1153–1163. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hentges P, Van Driessche B, Tafforeau L, وآخرون.: Three novel antibiotic marker cassettes for gene disruption and marker switching in Schizosaccharomyces pombe.Yeast. 2005 22(13): 1013–1019. PubMed Abstract | Publisher Full Text Hottinger-Werlen A, Schaack J, Lapointe J, وآخرون.: Dimeric tRNA gene arrangement in Schizosaccharomyces pombe allows increased expression of the downstream gene. الدقة الأحماض النووية. 1985 13(24): 8739–8747. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hsu PD, Lander ES, Zhang F: Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 157(6): 1262–1278. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Jacobs JZ, Ciccaglione KM, Tournier V, وآخرون.: Implementation of the CRISPR-Cas9 system in fission yeast. نات كومون. 2014 5: 5344. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, وآخرون.: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 337(6096): 816–821. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Lock A, Rutherford K, Harris MA, وآخرون.: PomBase 2018: user-driven reimplementation of the fission yeast database provides rapid and intuitive access to diverse, interconnected information. الدقة الأحماض النووية. 2019 47(D1): D821–D827. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Longmuir S, Akhtar N, MacNeill SA: Unexpected insertion of carrier DNA sequences into the fission yeast genome during CRISPR-Cas9 mediated gene deletion. BMC Res Notes. 2019 12(1): 191. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Mata J, Lyne, R, Burns G, وآخرون.: The transcriptional program of meiosis and sporulation in fission yeast. نات جينيه. 2002 32(1): 143–147. PubMed Abstract | Publisher Full Text Moreno S, Klar A, Nurse P, وآخرون.: Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.طرق الانزيم. 1991 194: 795–823. PubMed Abstract | Publisher Full Text Orthwein A, Noordermeer SM, Wilson MD, وآخرون.: A mechanism for the suppression of homologous recombination in G1 cells. طبيعة سجية. 2015 528(7582): 422–426. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Ragunathan K, Jih G, Moazed D, وآخرون.: Epigenetics. Epigenetic inheritance uncoupled from sequence-specific recruitment. Science. 2015 348(6230): 1258699. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Rodríguez-López M, Cotobal C, Fernández-Sánchez O, وآخرون.: A CRISPR/Cas9-based method and primer design tool for seamless genome editing in fission yeast [version 3 peer review: 2 approved]. Wellcome Open Res. 2016 1: 19. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Ryan OW, Skerker JM, Maurer MJ, وآخرون.: Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. eLife. 2014 3: e03703. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Sabatinos SA, Forsburg SL: Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.طرق الانزيم. 2010 470: 759–795. PubMed Abstract | Publisher Full Text Sorida M, Hirauchi T, Ishizaki H, وآخرون.: Regulation of ectopic heterochromatin-mediated epigenetic diversification by the JmjC family protein Epe1. بلوس جينيت. 2019 15(6): e1008129. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Torres-Garcia S, Yaseen I, Shukla M, وآخرون.: Epigenetic gene silencing by heterochromatin primes fungal resistance. طبيعة سجية. 2020 585(7825): 453–458. PubMed Abstract | Publisher Full Text Torres-Garcia S: SpEDIT: A fast and efficient CRISPR/Cas9 method for fission yeast [Data set]. Zenodo. 2020. http://www.doi.org/10.5281/zenodo.4247568 Trickey M, Grimaldi M, Yamano H, وآخرون.: The anaphase-promoting complex/cyclosome controls repair and recombination by ubiquitylating Rhp54 in fission yeast. مول الخلية بيول. 2008 28(12): 3905–3916. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Wang J, Reddy BD, Jia S, وآخرون.: Rapid epigenetic adaptation to uncontrolled heterochromatin spreading. eLife. 2015 4: e06179. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Yamagishi Y, Sakuno T, Shimura M, وآخرون.: Heterochromatin links to centromeric protection by recruiting shugoshin. طبيعة سجية. 2008 455(7210): 251–255. PubMed Abstract | Publisher Full Text Zhang XR, He JB, Wang YZ, وآخرون.: A Cloning-Free Method for CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Fission Yeast. G3 (بيثيسدا). 2018 8(6): 2067–2077. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Zhao Y, Boeke JD: Construction of Designer Selectable Marker Deletions with a CRISPR-Cas9 Toolbox in Schizosaccharomyces pombe and New Design of Common Entry Vectors. G3 (بيثيسدا). 2018 8(3): 789–796. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Zofall M, Yamanaka S, Reyes-Turcu FE, وآخرون.: RNA elimination machinery targeting meiotic mRNAs promotes facultative heterochromatin formation. Science. 2012 335(6064): 96–100. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text

Looking for the Open Peer Review Reports?

They can now be found at the top of the panel on the right, linked from the box entitled Open Peer Review. Choose the reviewer report you wish to read and click the 'read' link. You can also read all the peer review reports by downloading the PDF.